جین تھراپی مصنوعات کے وائرل کلیئرنس کی توثیق کے مطالعہ کے پروٹوکول کے لیے کلیدی ڈیزائن کے تحفظات

ICH Q5A(R2)-انٹرنیشنل ہارمونائزیشن فاؤنڈیشن

ICH Q5A(R2) کو باضابطہ طور پر 1 نومبر 2023 کو اپنایا گیا تھا، اور یہ وائرل حفاظتی تشخیص کے لیے بنیادی بین الاقوامی رہنمائی دستاویز کی نمائندگی کرتا ہے۔ 1999 میں شائع ہونے والے Q5A(R1) کے مقابلے میں، R2 ورژن میں اہم اپ ڈیٹس میں شامل ہیں: مسلسل مینوفیکچرنگ میں وائرل سیفٹی کی تشخیص پر ایک نیا شامل کردہ باب (باب 7)؛ وائرل کلیئرنس کی حکمت عملی کی بنیاد کے طور پر خطرے کی تشخیص کا ایک مضبوط کردار؛ وائرل کا پتہ لگانے کے تحفظات میں اگلی-جنریشن سیکوینسنگ (NGS) کو شامل کرنا؛ اور نئی مصنوعات اور مینوفیکچرنگ کے عمل کی تشخیص کے لیے واضح تقاضے Q5A(R2) کو ایف ڈی اے، ای ایم اے، اور پی ایم ڈی اے سمیت ریگولیٹری حکام نے اپنایا ہے، جو دنیا بھر میں وائرل کلیئرنس کی توثیق کے لیے ایک متحد تکنیکی فریم ورک فراہم کرتا ہے۔

NMPA-چینی ریگولیٹری نظام

وائرل سیفٹی کے لیے NMPA ریگولیٹری فریم ورک متعدد سطحوں پر محیط ہے:

دستاویز کی سطح	دستاویز کا نام	ایشو کا سال
بنیادی دستاویز	خون کی مصنوعات سے وائرس کو ہٹانے/غیر فعال کرنے کے لیے تکنیکی رہنما خطوط	2002
بنیادی دستاویز	حیاتیاتی بافتوں کے وائرل سیفٹی ایویلیوایشن کے تکنیکی جائزے کے عمومی اصول	2005
پروڈکٹ-مخصوص گائیڈ لائن	ریکومبیننٹ اڈینو-ایسوسی ایٹڈ وائرس (rAAV) ویکٹر-Vivo جین تھراپی پروڈکٹس پر مبنی کلینکل ٹرائل ایپلی کیشنز کی فارماسیوٹیکل ریسرچ اور تشخیص کے لیے تکنیکی رہنما خطوط	2023
پروڈکٹ-مخصوص گائیڈ لائن	Recombinant Adeno کے فارماسیوٹیکل معیار کے لیے عام تکنیکی تقاضے	2025
جدید رہنما خطوط	تھراپیٹک ریکومبیننٹ پروٹین پروڈکٹس (ٹرائل) کے کلینیکل ٹرائل ایپلی کیشنز کے لیے وائرل کلیئرنس کے عمل کے پلیٹ فارم کی توثیق کے لیے تکنیکی رہنما خطوطa	2024

a: یہ رہنما خطوط پہلی بار اس بات کی نمائندگی کرتا ہے جب چینی ریگولیٹری اتھارٹی نے وائرل کلیئرنس کے عمل کے پلیٹ فارم کی توثیق کے لیے منظم تکنیکی تقاضے طے کیے ہیں، اور یہ ICH Q5A(R2) کی روح کے مطابق ہے۔

FDA اور EMA-امریکی اور یورپی ریگولیٹری تقاضے

FDA نے باضابطہ طور پر جنوری 2024 میں ICH Q5A(R2) پر مبنی ایک صنعت رہنمائی دستاویز جاری کی۔ اس کے علاوہ، ریاستہائے متحدہ فارماکوپیا (USP) باب<1050.1>وائرل کلیئرنس کے طریقہ کار کے ڈیزائن، تشخیص، اور خصوصیت کے بارے میں ضمنی تکنیکی رہنمائی فراہم کرتا ہے۔ FDA ہر دو سال بعد وائرل کلیئرنس سمپوزیم کا اہتمام کرتا ہے۔ 2023 کے سمپوزیم میں جدید ترین موضوعات جیسے کہ ناول کے طریق کار، مسلسل تیاری، ناول کرومیٹوگرافی میڈیا، اور جذب کرنے والے فلٹرز پر توجہ دی گئی۔ EMA کے بنیادی رہنمائی کے دستاویزات میں CPMP/BWP/268/95 (وائرس کی توثیق کے مطالعہ پر رہنمائی کے لیے نوٹ: وائرس کے غیر فعال ہونے اور ہٹانے کی توثیق کرنے والے مطالعات کا ڈیزائن، شراکت اور تشریح) اور EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 بائیوٹیکوولوجیکل آن لائن ٹیکنالوجی تحقیقاتی دواؤں کی مصنوعات)، دونوں کو ICH Q5A(R2) کے ساتھ ہم آہنگ کیا گیا ہے۔

وائرل آلودگی کے ذرائع کی شناخت

ICH Q5A(R2) اس بات پر زور دیتا ہے کہ وائرل کلیئرنس کی توثیق کا ڈیزائن خطرے کی جامع تشخیص پر مبنی ہونا چاہیے۔ جین تھراپی کی مصنوعات کے لیے، وائرل آلودگی کے ذرائع کی شناخت کو درج ذیل سطحوں پر توجہ دینی چاہیے:

سیل بینک لیول: اینڈوجینس وائرسز (مثلاً، ریٹرو وائرل ذرات) اور دیر سے متعدی وائرس جو کہ ممکنہ طور پر پروڈکشن سیل سبسٹریٹس (جیسے، HEK293، CHO، HeLa) میں محفوظ ہیں۔ HEK293 خلیات میں endogenous Ad5 E1 تسلسل اور تقریباً 900 bp EBV ٹکڑا ہوتا ہے، اور نقل تیار کرنے کے قابل ہوتے ہیں لہذا، خطرے کی تشخیص میں اس خطرے پر خاص توجہ دی جانی چاہیے۔

مددگار وائرس کی سطح: AAV ویکٹر پروڈکشن میں عام طور پر ایسے طریقوں کو استعمال کیا جاتا ہے جیسے ہیلپر پلاسمڈ کا استعمال کرتے ہوئے ٹرپل ٹرانسفیکشن، جو نقل تیار کرنے کا خطرہ رکھتے ہیں-قابل ایڈینو وائرس (RCA)۔ اسی طرح، لینٹیو وائرل ویکٹر کی پیداوار میں استعمال ہونے والے پیکیجنگ سیلز نقل تیار کر سکتے ہیں-مجاز لینٹیو وائرس (RCL)۔

خام مال کی سطح: مینوفیکچرنگ میں استعمال ہونے والے خام مال، بشمول سیل کلچر میڈیا، فیڈز، اور انزائمز کے ذریعے ایڈونٹیٹیو وائرس متعارف کرائے جا سکتے ہیں۔ یہ خطرہ خاص طور پر اس وقت اہم ہوتا ہے جب جانوروں سے ماخوذ اجزاء-استعمال کیے جاتے ہیں (مثلاً، فیٹل بووائن سیرم، ٹرپسن ڈائجسٹ حل)۔

خطرے کے فرق: جین تھراپی بمقابلہ روایتی ریکومبیننٹ پروٹین

رسک ڈائمینشن	روایتی ریکومبیننٹ پروٹین مصنوعات	جین تھراپی مصنوعات
وائرل ذریعہ	سیل بینک سے اینڈوجینس وائرس؛ مہلک وائرس	سیل بینک وائرس؛ مددگار وائرس؛ نقل -مجاز ویکٹرز (RCV/RCL)؛ میزبان جینوم انضمام
سیل سبسٹریٹ	CHO، NS0، Sp2/0 اور دیگر اچھی خاصی-خریدار سیل لائنز	HEK293، HeLa، CHO، وغیرہ؛ کچھ سیل لائنیں ٹیومرجینک اصل کی ہیں۔
مصنوعات کی خصوصیات	پروٹین پر مبنی دوا- اچھی طرح سے-تعریف شدہ ڈھانچہ	وائرل ویکٹر؛ بائیو سیفٹی کے خطرات لاحق ہیں۔
توثیق کی حکمت عملی	ملٹی-مرحلہ وائرل کلیئرنس؛ عمل قدم کی توثیق پر زور	RCV/RCL کا پتہ لگانے کی ضرورت ہے۔ توثیق اور جانچ دونوں ضروری ہیں۔
پلیٹ فارم کی توثیق	S/D، کم پی ایچ، نینو فلٹریشن جیسے قائم شدہ عمل پر لاگو ہوتا ہے۔	ویکٹر کی اقسام کے تنوع کی وجہ سے محدود قابل اطلاق

ٹیبل 1. وائرل سیفٹی کے خطرات کا موازنہ: جین تھراپی مصنوعات بمقابلہ روایتی ریکومبیننٹ پروٹین مصنوعات

عمومی اصول

وائرل کلیئرنس توثیق پروٹوکول کے ڈیزائن میں انڈیکیٹر وائرس کا انتخاب ایک مرکزی عنصر ہے۔ ICH Q5A(R2) کا تقاضا ہے کہ وائرس کے اشارے کا انتخاب خطرے کی تشخیص پر مبنی ہو اور درج ذیل عوامل کو مدنظر رکھا جائے:

پروڈکشن سیل سبسٹریٹ (متعلقہ وائرس) سے وائرس کی مطابقت

وائرس کی فزیک کیمیکل خصوصیات (لفافہ/غیر-لفافہ، DNA/RNA، سائز کی حد)

جسمانی/کیمیائی علاج کے لیے وائرس کی مزاحمت

وائرس کی شناخت اور بایو سیفٹی

جین تھراپی مصنوعات کے لیے، انڈیکیٹر وائرس کے انتخاب پر بھی غور کرنا چاہیے: خود ویکٹر وائرس کا کردار بطور "متعلقہ وائرس"؛ مددگار وائرس کی آلودگی کا ممکنہ خطرہ؛ اور نقل تیار کرنے{0}}قابل وائرسز (RCV/RCL) کے لیے پتہ لگانے اور توثیق کے تقاضے۔

تجویز کردہ انڈیکیٹر وائرس پینل

وائرس	قسم	لفافہ	جینوم	سائز (nm)	انتخاب کی دلیل / درخواست
ایم وی ایم	پارو وائرس	کوئی نہیں۔	ssDNA	18–26	غیر-لفافہ ماڈل؛ سب سے چھوٹا سائز اور سب سے زیادہ مزاحمت؛ نینو فلٹریشن کی توثیق کے لیے موزوں (عام طور پر rAAV ویکٹر پروڈکٹس کے لیے لاگو نہیں ہوتا)
پی پی وی	پارو وائرس	کوئی نہیں۔	واحد دھاگے والا DNA	18–26	غیر-لفافہ ماڈل؛ خون کی مصنوعات کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والا انڈیکیٹر وائرس
ریو-3	ریوائرس	کوئی نہیں۔	ڈی ایس آر این اے	60–80	غیر-لفافہ ماڈل؛ درمیانے سائز؛ اعلی جسمانی استحکام
پی آر وی	ہرپیس وائرائڈائی	جی ہاں	ڈی ایس ڈی این اے	150–200	لفافہ ماڈل؛ بڑے سائز؛ میزبان کی وسیع رینج
X-MuLV	ریٹرو وائرس	جی ہاں	ssRNA	80–110	لفافہ ریٹرو وائرس ماڈل؛ CHO-ماخوذ سیل سبسٹریٹس کے لیے مناسب
بی وی ڈی وی	فلیوی وائرس فیملی	جی ہاں	ssRNA	40–60	لفافہ ماڈل؛ کیمیائی غیر فعال کرنے کے طریقوں کا جائزہ لینے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے (HCV سروگیٹ)
وی ایس وی	ریبڈووائرائڈے	جی ہاں	ssRNA	70	لفافہ ماڈل؛ وسیع پی ایچ رواداری؛ کم-پی ایچ غیر فعال ہونے کی توثیق کے لیے موزوں

جدول 2. جین تھراپی مصنوعات کی وائرل کلیئرنس کی توثیق کے لیے تجویز کردہ انڈیکیٹر وائرس پینل

AAV ویکٹر پروڈکٹس کے لیے خصوصی تحفظات

ریکومبیننٹ AAV ویکٹر پروڈکٹس کے لیے، NMPA تکنیکی رہنما خطوط برائے فارماسیوٹیکل ریسرچ اینڈ ایویلیوایشن آف کلینیکل ٹرائل ایپلیکیشنز برائے rAAV ویکٹر-Vivo جین تھراپی پروڈکٹس کی بنیاد پر نقل تیار کرنے-مجاز AAV (rcAAV) کی کھوج پر توجہ دینے کی ضرورت ہے۔ rcAAV سے مراد AAV ہے جو خود مختار نقل کے قابل ہے، جو عام طور پر مددگار پلاسمڈ اور پروڈکٹ AAV جینوم کے درمیان ہم آہنگی سے پیدا ہوتا ہے۔ آر سی اے اے وی کی کھوج عام طور پر متعدی اسیس یا کیو پی سی آر طریقوں سے کی جاتی ہے، جو دوائی کے مادے اور صاف شدہ پروڈکٹ پر الگ الگ کی جاتی ہے۔

یہ بات قابل غور ہے کہ AAV ویکٹر پروڈکٹس کے لیے بہاو صاف کرنے کے عمل میں عام طور پر نیوکلیز ہضم، کرومیٹوگرافی (AEX)، نینو فلٹریشن، اور آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی (CEX/IEX) شامل ہیں۔ روایتی وائرل کلیئرنس کی توثیق میں، ان عمل کے اقدامات کے نتیجے میں خود AAV ویکٹر کے اہم نقصانات ہو سکتے ہیں۔ لہٰذا، ویکٹر اور انڈیکیٹر وائرس کے درمیان تعامل کو اسکیل-ڈاؤن ماڈل ڈیزائن کے دوران احتیاط سے سمجھا جانا چاہیے۔ عمل کے کچھ مراحل (مثلاً، نینو فلٹریشن) کے لیے جہاں AAV ویکٹر کے نقصانات کافی ہوتے ہیں، اس کا جائزہ لیا جانا چاہیے کہ آیا توثیق کے اعداد و شمار کی بنیاد پر عمل کی ایڈجسٹمنٹ کی ضمانت دی گئی ہے (مثلاً، نینو فلٹریشن جھلی کے تاکنے کے سائز کی ایڈجسٹمنٹ)۔

عمومی اصول

اسکیل-ڈاؤن ماڈل (SDM) وائرل کلیئرنس کی توثیق کا بنیادی ٹول ہے۔ اس کا ڈیزائن مینوفیکچرنگ کے عمل کی وائرل کلیئرنس کارکردگی کو درست طریقے سے ظاہر کرتا ہے۔ ICH Q5A(R2)، سیکشن 6.2.2، واضح طور پر اس بات کا تقاضا کرتا ہے کہ سکیل-ڈاؤن ماڈل مینوفیکچرنگ کے عمل کے ساتھ کلیدی پیرامیٹرز میں مطابقت برقرار رکھے۔ جین تھراپی مصنوعات کے لیے، SDM ڈیزائن میں درج ذیل تحفظات خاص طور پر اہم ہیں:

تنقیدی عمل کے پیرامیٹرز کی نمائندگی

پیمانہ-ڈاؤن ماڈل مندرجہ ذیل پیرامیٹرز میں مینوفیکچرنگ کے عمل کے مطابق ہونا چاہئے: کرومیٹوگرافک حالات (بفر کمپوزیشن، پی ایچ، چالکتا)؛ لوڈنگ کا تناسب (ویکٹر/سپرناٹینٹ پروٹین ماس ریشو)؛ رابطہ وقت اور درجہ حرارت؛ بہاؤ کی شرح/رہائش کا وقت؛ مصنوعات کی پاکیزگی اور ساخت. AAV مصنوعات کے لیے، نینو فلٹریشن کی کارکردگی پر ویکٹر پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن اور خالی کیپسڈ مواد کے اثر پر بھی خاص طور پر توجہ دی جانی چاہیے۔

ماڈل کی اہلیت کے تقاضے

ICH Q5A(R2) کو اسکیل-ڈاؤن ماڈل کی مناسب اہلیت درکار ہے، بشمول: پروڈکٹ کے معیار کی خصوصیات کا موازنہ (مثلاً، پاکیزگی، بازیابی، کثافت)؛ اہم عمل پیرامیٹر مستقل مزاجی کی اہلیت؛ اور اسکیل کو یقینی بنانا-ڈاؤن ماڈل مینوفیکچرنگ کے عمل کی تغیر پذیری کو حاصل کرتا ہے۔ کرومیٹوگرافی کے مراحل کے لیے، چوٹی پروفائل، ایلیوشن، اور واش کی مستقل مزاجی کوالیفائی ہونا چاہیے۔ نینو فلٹریشن کے اقدامات کے لیے، حجم کی گنجائش اور مصنوعات کی ساخت کے اثرات کی تصدیق کی جانی چاہیے۔

ایل آر وی کیلکولیشن فارمولا

لاگ کمی کی قیمت (LRV) وائرل کلیئرنس کی افادیت کی پیمائش کے لیے بنیادی میٹرک ہے۔ ICH Q5A(R2)، سیکشن 6.5، LRV کیلکولیشن کے طریقوں اور شماریاتی علاج کی تفصیلی وضاحت فراہم کرتا ہے۔ LRV کیلکولیشن کا بنیادی فارمولا یہ ہے: LRV=log₁₀(N₀/N)، جہاں N₀ وائرس کے بڑھنے کے بعد ابتدائی وائرس ٹائٹر ہے اور پروسیس ٹریٹمنٹ کے بعد N بقایا وائرس ٹائٹر ہے۔ جب بقایا وائرس ٹائٹر پرکھ کی کھوج کی حد سے نیچے آجاتا ہے، تو تخمینہ لگانے کے طریقے جیسے کہ پوسن کی تقسیم کا استعمال کیا جانا چاہیے (مثلاً، بڑے-حجم کی جانچ)۔

اعتماد کے وقفوں کا اطلاق

ICH Q5A(R2) اور EMA CPMP/BWP/268/95 دونوں کو LRV حساب کے نتائج کے اعتماد کے وقفہ کی تشخیص کی ضرورت ہوتی ہے۔ 95% اعتماد کا وقفہ عام طور پر لاگو ہوتا ہے۔

تاثیر کا معیار

خون کی مصنوعات سے وائرس کو ہٹانے/غیر فعال کرنے کے لیے NMPA تکنیکی رہنما خطوط کے مطابق، 4 لاگ سے زیادہ یا اس کے برابر وائرس کی کمی اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ عمل کا مرحلہ وائرس کو ہٹانے/غیر فعال کرنے کے لیے موثر ہے۔ تاہم، یہ کسوٹی مطلق حد نہیں ہے اور اسے غیر فعال ہونے کے حرکیات کے منحنی خطوط، اشارے کے وائرس کے انتخاب کے لیے سائنسی استدلال، اور توثیق پروٹوکول ڈیزائن کی مجموعی درستگی کے ساتھ مجموعی انداز میں جانچا جانا چاہیے۔ جین تھراپی کی مصنوعات کے لیے، تمام عمل کے مراحل میں کلیئرنس کی مجموعی صلاحیت پر خصوصی توجہ دی جانی چاہیے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ وائرل سیفٹی پروفائل قابل قبول سطح پر ہے۔

نینو فلٹریشن کی درخواست اور چیلنجز

وائرس-ریٹینٹیو فلٹریشن (نینو فلٹریشن) جین تھراپی مصنوعات کے بہاو صاف کرنے میں وائرل کلیئرنس کا ایک اہم مرحلہ ہے۔ عام وائرس-ریٹینٹیو فلٹرز میں تقریباً 20 nm کا سوراخ ہوتا ہے۔ نینو فلٹریشن کا وائرل کلیئرنس میکانزم بنیادی طور پر سائز-کی بنیاد پر اخراج ہے، اور یہ جھلی کے سوراخ کے سائز سے بڑے زیادہ تر وائرسوں کو مؤثر طریقے سے ہٹا سکتا ہے، بشمول غیر-چھوٹے پارو وائرس جیسے MVM اور PPV۔

تاہم، جین تھراپی کی مصنوعات کے لیے نینو فلٹریشن کو منفرد چیلنجز کا سامنا ہے: AAV ویکٹرز کا سائز (تقریباً 20–26 nm) کچھ انڈیکیٹر وائرسز سے ملتا جلتا ہے (مثال کے طور پر، MVM, 18–26 nm)، جس کے نتیجے میں ویکٹر کی بحالی میں کمی واقع ہو سکتی ہے۔ خالی کیپسڈ فلٹریشن فلوکس اور وائرل برقرار رکھنے کی کارکردگی کو متاثر کر سکتے ہیں۔ ویکٹر کے ارتکاز کے ساتھ نمونہ کی viscosity نمایاں طور پر بڑھ سکتی ہے۔ لہذا، نینو فلٹریشن کی توثیق کے لیے SDM ڈیزائن کو فلٹریشن کی کارکردگی پر ویکٹر پارٹیکل سائز کی تقسیم اور خالی کیپسڈ مواد کے اثرات کا مکمل حساب دینا چاہیے، اور مناسب طور پر بڑے تاکنا سائز کے ساتھ نینو فلٹریشن جھلیوں کے استعمال پر غور کیا جانا چاہیے۔

کرومیٹوگرافی کے مراحل کی وائرل کلیئرنس کی تشخیص

آئن ایکسچینج کرومیٹوگرافی (IEX) AAV پروڈکٹ پیوریفیکیشن کے عمل میں ایک بنیادی مرحلہ ہے، عام طور پر نیوکلیز ہاضمے کو ملازمت دیتا ہے جس کے بعد خالی اور عیب دار کیپسڈز کو پکڑنے کے لیے ایون ایکسچینج کرومیٹوگرافی (AEX)، یا مکمل کیپسڈز کو ٹھیک صاف کرنے کے لیے کیشن ایکسچینج کرومیٹوگرافی (CEX)۔ کرومیٹوگرافی کے مراحل میں وائرل کلیئرنس میکانزم میں سائز کا اخراج، الیکٹرو سٹیٹک تعاملات، وابستگی کے تعاملات اور دیگر عوامل شامل ہیں۔ FDA 2023 وائرل کلیئرنس سمپوزیم میں ہونے والے مباحثوں نے اس بات پر روشنی ڈالی کہ کرومیٹوگرافی کے مراحل کی وائرل کلیئرنس کی افادیت متعدد عوامل سے متاثر ہوتی ہے، بشمول لوڈنگ کی گنجائش، پی ایچ، چالکتا، اور رال سائیکلنگ؛ جامع تشخیص کے لیے ایک کثیر-فیکٹر آرتھوگونل ڈیزائن اپروچ اپنایا جانا چاہیے۔

مسلسل مینوفیکچرنگ میں وائرل سیفٹی کنٹرول

ICH Q5A(R2) کا نیا شامل کردہ باب 7 مسلسل مینوفیکچرنگ میں وائرل حفاظتی تشخیص کے لیے مخصوص تقاضوں کا تعین کرتا ہے۔ جین تھراپی مصنوعات کے لیے، مسلسل مینوفیکچرنگ ایک اہم ترقی کی سمت بن گئی ہے، لیکن یہ نئے وائرل حفاظتی چیلنجز کو بھی متعارف کراتی ہے۔ مسلسل مینوفیکچرنگ میں وائرل سیفٹی کنٹرول کی حکمت عملیوں میں شامل ہیں: ان- لائن وائرس بیریئر فلٹرز کو روک تھام کے اہم اقدامات کے طور پر؛ رہائش کے اوقات اور عمل کے بہاؤ کا مناسب ڈیزائن؛ مقررہ ہولڈ اوقات کے ساتھ غیر فعال ہونے کے اقدامات کو شامل کرنا؛ اور عمل کی تجزیاتی ٹکنالوجی (PAT) کا بہتر اطلاق- اہم عمل کے پیرامیٹرز کی حقیقی وقت کی نگرانی کے لیے۔